جداسازی و کلونینگ cdna کد کننده آنزیم طویل کننده اسیدهای چرب زنجیره بلند با چند باند غیر اشباع از mortierella alpina

امروزه با مطالعات فراوان دانشمندان روی بیماری های قلبی عروقی و بسیاری از بیماری های دیگر، ارتباط این بیماری ها با نقص در سوخت ساز یا کمبود اسیدهای چرب زنجیره بلند چند باند دوگانه به اثبات رسیده است. به همین دلیل استفاده از این اسیدهای چرب به صورت مکمل های غذایی و همچنین در صنایع آرایشی و دارویی رو به افزایش است. تلاش های زیادی برای یافتن منابع جدید در تولید اسیدهای چرب خاص و با مقادیر تولید بالا صورت گرفته است. در حین این تحقیقات دانشمندان به ریزسازواره های روغنی رو آوردند. از بین این ریز سازواره ها قارچ mortierella alpina با تولید بالای aa مورد توجه قرار گرفته است. در تحقیق حاضر تلاش بر آن شد برای افزایش راندمان تولید از روش های مهندسی ژنتیک استفاده شود. برای این منظور تلاش شد تا آنزیم کلیدی موثر در تولید aa جدا سازی و کلون شود. برای جداسازی ژن روش rt-pcr استفاده گردید. ژن جدا شده در ناقل ptz57r/t کلون و ناقل به باکتری e.coli سویه tg1 منتقل شد. برای بررسی وجود ژن از فناوری های مختلفی ( مانند pcr ,clony pcr و هضم آنزیمی) استفاده شد. ژن کلون شده در ناقل ptz57r/t با هضم آنزیمی و تخلیص از ژل جداسازی و در ناقل ppicza (برای بررسی بیان در مخمر) کلن گردید. برای بررسی وجود ژن در داخل ناقل از فناوری های مختلف ( مانند pcr ,clony pcr، هضم آنزیمی و sequencing) استفاده شد. سپس ناقل حاوی ژن طویل ساز به مخمر pichia pastoris سویه x-33 (invitrogen) معرفی گردید. مخمر حاوی ناقل با استفاده از محیط انتخابگر حاوی زئوسین مورد غربالگری اولیه قرار گرفت و کلنی های رشد کرده با استفاده از pcr برای وجود ژن بررسی شدند. یک کلنی حاوی ژن انتخاب و برای سنجش آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. برای سنجش آنزیم، مخمر در حضور µm25 سوبسترا به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شد. سپس استخراج چربی صورت گرفت و با استفاده از دستگاه gc، نوع و مقدار اسید چرب مخمر مورد بررسی قرار گرفت. بررسی ها 58 درصد تبدیل سوبسترا به محصول را نشان دادند.